HPLC

Posted: Desember 6, 2012 in Uncategorized

romatografi cairan kinerja tinggi (HPLC)

PEMBAHASAN

2.1 PENGERTIAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (HPLC)
HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom. HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat. HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.

http://www.idonbiu.com/2009/10/mengenal-kromatografi-cair-kinerja.html

2.2 JENIS HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.

2. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

3. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.

5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.
http://lansida.blogspot.com/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html

2.3 PRINSIP DASAR HPLC
Prinsip kerja HPLC adalah sebagai berikut :
Dengan bantuan pompa fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solut-solut tersebut akan keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram kromatografi gas. Seperti pada kromatografi gas, jumlah peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. Computer dapat digunakan untuk mengontrol kerja sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC.

2.4 INSTRUMENTASI KROMATOGRAFI CAIRAN KINERJA TINGGI

Instrumentasi Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi, yaitu:

A. Fasa Gerak
Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Berbeda dengan kromatografi gas, HPLC mempunyai lebih banyak pilihan fasa gerak, dibandingkan dengan fasa gerak untuk kromatografi gas. Dalam kromatografi gas, fasa gerak hanya sebagai pembawa solute melewati kolom menuju detektor. Sebaliknya dalam HPLC,fasa gerak selain berfungsi membawa komponen-komponen campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solute-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.

PERSYARATAN FASA GERAK HPLC
Zat cair yang akan digunakan sebagai fasa gerak HPLC harus memenuhi beberapa persyaratan berikut:
Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan di analisis.
Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat menganggu interpretasi kromatogram.
Zat cair harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.
Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.
Zat cair tidak kental.
Sesuai dengan detektor.

JENIS FASA GERAK
Fasa gerak untuk kromatografi partisi, adsorpsi, dan penukar ion bersifat interaktif dalam arti fasa gerak berinteraksi dengan komponen-komponen cuplikan. Akibatnya, waktu retensi sangat dipengaruhi oleh jenis pelarut. Sebaliknya fasa gerak untuk kromatografi eksklusi bersifat non interaktif. Oleh karena itu, waktu retensi dengan kromatografi ini tidak bergantung pada komposisi fasa gerak.
B. Pompa
Pompa dalam HPLC dapat dianalogikan dengan jantung pada manusia yang berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Pompa yang dapat digunakan dalam HPLC harus memenuhi persyaratan :
1. Menghasilkan tekanan sampai 600 psi
2. Keluaran bebas pulsa
3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit
4. Bahan tahan korosi
Dikenal tiga jenis pompa yang masing-masing memiliki kenutungan dan kekurangannya yaitu pompa reciprocating, displacement dan pneumatic.

Pompa reciprocating
Jenis pompa ini sekarang banyak dipakai. Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa batang gelas dan berkontak langsung dengan pelarut.
Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung tekanan baik kolom dan viskositas pelarut. Selain itu, keluaran pompa ini bebas pulsa. Akan tetapi pompa ini keterbatasan kapasitas pelarut (±250 mL) dan tidak mudah untuk melakukan pergantian pelarut.
Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut di dorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunyai keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan tekanan balik kolom.

C. Unit Sistem Penyuntikan Atau Penginjeksian Sampel

Gambar 2. Tipe injektor katup putaran

Kadang kala, faktor ketidaktepatan pengukuran HPLC terletak pada keterulangan pemasukan cuplikan ke dalam peking kolom. Masalahnya, kebanyakan memasukan cuplikan ke dalam kolom dapat menyebabkan band broadening. Oleh karena itu, cuplikan yang dimasukkan harus sekecil mungkin, beberapa puluh mikroliter. Selain itu, perlu diusahakan tekanan tidak menurun ketika memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak. Berikut beberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam sistem HPLC :
1. Injeksi Syringe
Alat yang paling dulu dan paling mudah untuk memasukkan cuplikan adalah syringe. Syringe disuntikkan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikit lebih baik dari 2-3 % dan sering lebih jelek.
2. Injeksi ‘stop-flow’
Injeksi stop-flow adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom. Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali.
3. Kran Cuplikan
Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan. Untuk memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah: (a) sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi ‘load’, cuplikan masih berada dalam loop, (b) kran diputar untuk mengubah posisi ‘load’ menjadi posisi ‘injeksi’ dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. Loop dapat diganti-ganti dan tersedia berbagai ukuran volume dari 5 hingga 500μL. Dengan sistem pemasukan cuplikan ini memungkinkan memasukkan cuplikan pada tekanan 7000 psi dengan ketelitian tinggi. Juga loop mikro tersedia dengan volume 0,5 hingga 5 μL.
D. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:
• Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
• Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
• Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.
E. Detektor
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.
2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil.
3. Stabil dalam pengopersiannya.
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.
Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC antara lain :

http://lansida.blogspot.com/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html

2.5 CARA KERJA HPLC
Mula-mula solven diambil melalui pompa. Solven ini dikemudian masuk ke dalam katup injeksi berbutar, yang dipasang tepat pada sampel loop. Dengan pertolongan mikrosiring, sampel dimasukan ke dalam sampel loop yang kemudian bersama-sama dengan solven masuk ke dalam kolom. Hasil pemisahan dideteksi oleh detector, yang penampakannya ditunjukan oleh perekam (pencatat = recorder). Tekanan solven di atur dengan pengatur dan pengukur tekanan. Pompa pemasuk solven pada tekanan konstan hingga tekanan kurang lebih 4500 psi dengan laju alir rendah, yakni beberapa milliliter per menit.
Rekorder menghasilkan kromatogram zat-zat yang dipisahkan dari suatu sampel. Tahap pemekatan dengan ekstraksi solven dan penguapan untuk memperkecil volum sering kali diperlukan sebelum pengerjaan sampel dengan HPLC. Hal ini terutama sering dilakukan untuk analisis senyawa-senyawa hidrokarbon aromatic polisiklik (PAH) atau residu pestisida dalam makanan.
Sebagai alternative lain, sampel air dapat di absorpsi oleh suatu adsorben padat (C8 atau C18 yang terikat pada silica gel), diikuti dengan desorpsi dalam suatu solven yang kemudian langsung dimasukan kedalam kolom. Suatu solven dengan polaritas rendah, misalnya CH3 berair yang secara bertingkat mengalami perubahan menjadi CH3OH murni, menjamin pemisahan yang baik pada C-18 yang terikat pada silica gel.
http://yi2ncokiyute.blogspot.com/2010/12/blog-post.html

2.6 KELEBIHAN HPLC
KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG). Dalam banyak hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh efek pemisahan yang sama membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis. Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan yang lebih besar bagi para analis laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer pada KCKT karena teknik ini dapat digunakan untuk menambah sensitivitas detektor UV Visibel yang umumnya digunakan.
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan kromatografi cair klasik, antara lain:
Cepat: Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai
Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.
Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT
Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable). Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sma sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan
Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik: zat-zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat-zat tersebut.
Mudah rekoveri sampel: Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah sikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.
http://www.pdf.com/kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html

2.7 APLIKASI HPLC DALAM KEHIDUPAN
Beberapa aplikasi HPLC dalam kehidupan :
o HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.
o Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
o Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori
o Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin Zipax-SAX.
o Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.
o Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.
o Kromatografi cairan kinerja tinggi (KCKT/HPLC) digunakan untuk memisahkan golongan-golongan takatsiri, misalnya terpenoid tiggi, segala jenis senyawa fenol, alkaloid, lipid dan gula.

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

Logo WordPress.com

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Gambar Twitter

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Foto Facebook

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Foto Google+

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s